В основе метода проточной
цитометрии лежит измерение параметров каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии со скоростью до 3000 кл. в
секунду. Суспензию предварительно окрашенных
флуоресцирующими красителями (как правило, в роли красителей выступают
моноклональные антитела, коньюгированные с флуоресцентной меткой) клеток под
давлением прогоняют через капилляр. Клетки, подхваченные потоком жидкости,
выстраиваются друг за другом, образуя "цепочку" - принцип
гидродинамического фокусирования, благодаря которому создаются условия
ламинарного потока без перемешивания суспензии клеток с обтекающей жидкостью. Когда
такую струю пересекает сфокусированный лазерный луч, в точке пересечения потока
и луча одновременно оказывается, как правило, только одна клетка, что позволяет
избежать артефактов, связанных с разной удаленностью клеток от точки
пересечения лазерного луча с потоком.
Высокочувствительные
датчики, расположенные вблизи проточной ячейки, фиксируют рассеивание
света под
углом от 2 до 19°, которое называется прямым или малоугловым
светорассеиванием
(FSC) и под
углом 90° - боковое светорассеивание (SSC). Одновременно с этим
регистрируется излучение
флюорисцентных меток (FL1, FL2, и т.д.), имеющее строго
определенную для каждого красителя (флюорохрома) длину волны.
Таким образом, анализ клеток
производится по следующим основным параметрам:
* FSC (forward side scatter) - показатель прямого
светорассеяния, который характеризует размеры клеток.
* SSC (side scatter) - показатель бокового
светорассеяния, который отражает оптическую неоднородность цитоплазмы
клеток,
характер клеточных включений и гранулярность клетки. * FL1 – FL5
- каналы детекции
специфического флуоресцентного сигнала красителя на разной длине волны.
Использование нескольких
флюоресцентных меток позволяет проводить одновременный двух-,
трехцветный и
более анализ (Cytomics FC 500, которым располагает ИнБЮМ
позволяет работать одновременно с 5 метками), так как каждый флюорохром
при
прохождении через луч лазера испускает свет различной длины волны.
Наиболее
часто в качестве красящей метки применяется флюоресцеинизотиоционат
(FITC), который улавливается FL-1-детектором (первый канал
флюоресценции) (зеленый спектр), фикоэритрин (PE) - FL-2-детектором
(желтый спектр),
менее часто - тандем цианин - 5/фикоэритрин и пиридин хлорофилл (PerCp,
Cy5/PE) - FL-3-детектором и аллофикоцианин (APC) - FL-4-детектором.
