Объектом цитометрического исследования может быть СУСПЕНЗИЯ клеток (или частиц), размер которых - от 0,5 до 40 мкм. Примеры - морская вода с микроорганизмами, кровь, культура клеток/микроорганизмов (причем, это могут быть клетки тканей, которые специальной обработкой переводятся в суспензию). В суспензии не должно быть комков и цепочек клеток. Желательная концентрация клеток - около 100 тыс./мл.
В первую очередь, это количество и индивидуальные размеры клеток/частиц в суспензии, т.е. их физические свойства. Биологические переменные (а их огромное количество, например, содержание нуклеиновых кислот, физиологическая активность и т.д. и т.п.) определяются после окраски пробы флуорохромами (флуоресцентными красителями), специфическими для каждой переменной. В общем, подход тот же, что и в люминесцентной микроскопии, но проточная цитометрия позволяет автоматизировать счёт специфически окрашенных клеток. Поскольку в комплектацию цитометра не входили флуоресцентные красители, Вам необходимо располагать ими для работы на FC 500.
1) если Ваша задача - определить численность и размерный спектр (т.е. физические свойства) частиц в жидкости. Но в этом случае Вы не сможете отличать клетки от, скажем, минеральных или детритных частиц. В таком анализе используется 2 параметра - прямое (forward scatter, FS) и боковое рассеяние (side scatter, SS) света частицей. Детекторы флуоресценции при этом не применяются, а это означает, что какие-либо биологические переменные не могут быть исследованы. Чтобы выяснить, что данная частица - это живая клетка, необходимо применять флуоресцентные маркеры, например, красители, специфичные к нуклеиновым кислотам (акридиновый оранжевый, DAPI, SYBR Green I, Yo-Pro и др.).
2) если Вы работаете с фотоавтотрофными микроорганизмами, клетки которых содержат пигменты и, следовательно, обладают автофлуоресценцией. Проба микроводорослей, помещенная в проточный цитометр, даёт флуоресцентный сигнал в красной области (в дополнение к FS и SS). Таким образом, по этому сигналу, получаемому (или не получаемому) от каждой индивидуальной частицы, можно судить, живая ли это клетка или мертвая частица/клетка.
Спектр возможностей приточной цитометрии огромен, поэтому невозможно
дать даже приблизительный список флуорохромов (красителей), которые
могут быть использованы для тех или иных задач. Задача выбора
флуорохрома - это исключительно Ваша задача. Если до сих пор Вам не
приходилось сталкиваться с подобной информацией, мы рекомендуем
провести поиск в интернете. В качестве ключевых слов используйте
комбинацию терминов Вашей конкретной области исследования и проточной
цитометрии: flow cytometry, fluorochrome, fluorophore, fluorescent
stain/dye/marker, excitation, emission, 488 nm.
После того, как Вы определите круг флуорохромов, которые используются в
Вашей области, Вам необходимо отобрать те, которые пригодны для
использования на нашем приборе. Наш цитометр оснащен аргоновым лазером
с длинной волны 488 нм, которая соответствует синему цвету (поэтому
среди ключевых слов упоминалось "488 nm"). Этот лазер позволяет
применять до 80% известных флуорохромов, но надо проверить, в их ли
числе тот из них, который Вам необходим. Для каждого флуорохрома
указывают максимумы возбуждения (excitation) или поглощения(absorption)
и излучения или эмиссии (emission). Важно, чтобы максимум возбуждения
Вашего флуорохрома был как можно ближе к 488 нм.
Кроме того, что он оснащен великолепной японской оптикой, микроскоп имеет ряд других преимуществ: Во-первых, это инвертированный микроскоп (объектив размещается под предметным столом) с длинным фокусным расстоянием (можно просматривать пробы в емкостях большого объёма). Во-вторых, микроскоп оснащен видеокамерой, что позволяет запечатлеть наиболее интересные события в микромире. Фильм Нелли Гавриловой, снятый на этом микроскопе - яркий тому пример. В-третьих, микроскоп имеет блок для работы в люминесцентном свете (возбуждение в синей и ультрафиолетовой областях спектра).
