В основе метода проточной цитометрии лежит измерение оптических свойств клеток. Клетки по одиночке вводятся в ламинарный поток в проточной кварцевой кювете, где они пересекают сфокусированный световой пучок, не касаясь стенок кюветы. Источником света могут быть различные лазеры, ультрафиолетовая лампа или их комбинация. Свет определенной длины волны возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценивать сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и раскладывают на компоненты. Световые сигналы улавливаются и преобразуются в электрические импульсы фотоумножительным устройством. Далее информация обрабатывается в цифровом режиме. Величины, измеренные фотоумножителем, отображаются на гистограммах. Современные проточные цитофлуориметры позволяют одновременно измерять несколько (до восьми) параметров: рассеяние света на малые углы (до 10°), которое еще называют прямым светорассеянием (forward scattering или FSC); рассеяние света на угол 90°, т.н. боковое светорассеяние (side scattering или SSC]; интенсивность флуоресценции на разных длинах волн. Параметры светорассеяния позволяют проводить разделение клеток по размерам, форме, состоянию клеточной мембраны и характеристикам цитоплазмы.

    Методом проточной цитометрии можно получать самые разные данные: определять количество определенных антигенов, ДНК, РНК, исследовать клеточный метаболизм (например, измерять внутриклеточный рН), изучать транспорт ионов кальция и кинетику ферментативных реакций.

  Области применения проточной цитометрии: иммунофенотипирование (анализ субпопуляционного состава лимфоцитов, диагностика гемобластозов, определение содержания гемопоэтических стволовых клеток (CD34+) при трансплантациях костного мозга], анализ плоидности ДНК и анализ клеточного цикла, исследование экспрессии цитокинов, дифференциальная диагностика опухолей (в том числе солидных), анализ пролиферативного статуса клеток, определение минимальной остаточной болезни, определение HLA-B27 антигена, определение маркеров апоптоза.

   Многофункциональные проточные цитометры DAKO Galaxy™ позволяют осуществлять все указанные выше функции, поэтому широко используются для клинических и научных исследований. Проточные цитометры DAKO имеют модульную конструкцию, обеспечивающую максимальную гибкость и функциональность, и позволяют исследовать до восьми параметров, в т.ч. шести флюоресцентных. Возможность установки дополнительных источников света (аргоновый лазер, красный полупроводниковый лазер, УФ лампа) и каналов флуоресценции значительно расширяют круг решаемых на приборе задач.

   Традиционно концентрация клеток определяется путем разделения пробы на две части и сравнение результатов анализа иммунофенотипирования, выполненного на проточном цитометре с результатами подсчета клеток на гематологическом анализаторе. Такая процедура приводит к дополнительным затратам времени, средств и мощностей лабораторного оборудования. В настоящее время на рынке имеются наборы калибровочных частиц для определения концентрации клеток непосредственно на проточном цитометре, однако их использование также связано с дополнительными затратами. Только проточные цитометры DAKO Galaxy™ и DAKO Galaxy™ PRO позволяют точно определять концентрацию клеток без использования референс проб и калибровочных частиц. В основе используемого метода определения концентрации лежит прецизионное измерение объема образца с помощью сенсорных референсэлектродов.

   Проточные цитометры DAKO Galaxy™ являются полностью открытыми системами, что не ограничивает пользователя в выборе реагентов. Они работают под управлением программного обеспечения FlowMax, с помощью которого осуществляется регулировка скорости потока, устанавливаются параметры регистрации данных, управляется блок биологической защиты, осуществляется измерение объема при определении концентрации частиц, управление модулем сортировки частиц, измеряется уровень жидкости в sheath и waste емкостях. Программа FlowMax - это также мощный инструмент анализа, включая мультипараметрическую цветовую компенсацию, определение концентрации клеток и автоматическое составление отчетов.

   Программное обеспечение FlowMax имеет возможность создания единой панели для исследования сразу нескольких проб. Это очень удобно при проведении большого числа клинических исследований со стандартным набором реагентов в гематологических и иммунологических лабораториях, так как позволяет пользователю : задать протокол или шаблон для анализа, задать панель для исследования, определить пробирки, которые будут включены в панель, задать порядок следования пробирок, задать настройки прибора, включая параметры компенсации, задать названия параметров (например FL1 - CD4+ FITS), задать диапазон отображения данных - gating, определить форму отчета, который будет содержать результаты исследования.

   После задания всех параметров панели пользователь получает в ее лице удобный инструмент для сбора, анализа данных и создания готового отчета, содержащего результаты исследования проб от конкретного пациента.

   При анализе клеток, маркированных двумя, тремя или четырьмя антителами, коньюктированными с различными цветовыми метками, необходимо проводить компенсацию сигналов с флуоресцентных каналов проточного цитометра из-за перекрытии спектров эмиссии используемых красителей. С помощью программного обеспечения FlowMax можно проводить мультипараметрическую цветовую компенсацию как непосредственно во время измерения, так и после него. Компенсация проводится над сигналами в цифровой форме, поэтому всегда имеется возможность модифицировать параметры компенсации без потери результатов измерения. Следует напомнить, что в системах проточной цитометрии других производителей компенсация проводиться только во время измерения и впоследствии не может быть изменена.

   Программное обеспечение FlowMax позволяет создавать отчеты в используемом в лаборатории формате, что имеет следующие преимущества: автоматическая активация опции при использовании панели для исследования, программа Word 2000 позволяет создать отчет на любом языке, возможность создания шаблона, использование логотипа медицинского учреждения или лаборатории, произвольное размещение и размер гистограмм, включаемых в отчет, включение в отчет данных статистического анализа, включение в отчет формул, по которым проводились вычисления, включение в отчет комментариев к диагнозу, удобство в работе.

   С помощью проточных цитометров DAKO Galaxy™, в которых в качестве источника излучения используется УФ лампа, можно проводить исследования плоидности ДНК и выявлять атипичное содержание ДНК в клетках. Для определения ануэплоидности необходимо проводить анализ клеточной ДНК с высокой разрешающей способностью. Опухоли различных органов на разных стадиях развития характеризуются различным соотношением диплоидных и ануэплоидных клеточных популяций и присутствием различных клеточных линий внутри опухолевой ткани. Для некоторых классов новообразований эти параметры могут быть использованы для обнаружения новообразований на ранней стадии и оценки эффективности проводимой терапии.

   Проточная цитометрия позволяет определелить долю клеток, находящихся в S-фазо и оценить степень пролиферации. С помощью ДНК-гистограмм возможно четко разделить клетки, находящиеся в G1-. S- и G2/M-фазах клеточною чикла. Совокупность информации о содержании ДНК, маркеров апоптоза и клеточной пролиферации, имеет важное значение в дифференциальной диагностике онкологических заболеваний, DAKO предлагает широкий выбор материалов и оборудования для подготовки проб крови и солидных опухолей.

    DAKO Medimachine System - система для дезагрегации плотных тканей и солидных опухолей и получения клеточных и ядерных суспензий, необходимых как для проточной цитометрии,так и для культуральных исследований. Комплекс состоит из Medimachine, Medicon и Filcon.

   Medicon представляет собой стерильный контейнер с вмонтированным ножом, который приводится в действие Medimachine. Гомогенизированный (измельченный) образец ткани проходит сквозь сито и собирается в нижней части Medicon. Полученная клеточная суспензия фильтруется через Filcon, после чего готова к исследованию. Исключается риск контаминации при работе с инфекционным материалом.

   Набор реагентов DAKO Uti-Lyse™ является готовой системой для лизирования эритроцитов. Быстрый эффективный лизис эритроцитов с одновременной фиксацией и стабилизацией лейкоцитов позволяет использовать образцы в течении 24 часов.

   Набор реагентов DAKO IntraStain специально разработан для окрашивания внутриклеточных структур. Используется как подготовительный этап для антител, тройных к внутриклеточным антигенам (TdT, цитоплазматическис CDS, CD22. CD68, CD790., цитокины. IgM, миелопероксидазу) и позволяет проводить одновременный анализ поверхностных и внутриклеточных антигенов.

   Диагностика лейкозов лимфом в настоящее время одна из наиболее передовых областей использования проточной цитометрии. Иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга обеспечивает ключевой информацией для качественной диагностики и оценки прогноза заболевания. Осуществляя свою деятельность с момента появления гибридобной технологии, компания DAKO является одним из всемирно признанных лидеров в производстве моноклинальных антител и представляет самую широкую панель антител к клеточным рецепторам. Рекомендации и протоколы панелей антител DAKO для дифференциальной диагностики онкогематологических заболеваний основаны на многолетнем опыте исследователей всего мира.

   Трансплантация костного мозга (ТКМ) при лимфомах и лейкозах предполагает перенос стволовых мультипотентных клеток, ответственных за восстановление нормального гемо- и лимфопоэза, в противоположность гемотрансфузиям, которые дают временный эффект. Кроветворные клетки для ТКМ мотут быть получены из костного мозга, периферической и пуповинной крови. Процедура ТКМ более не является экспериментальным методом, а составляет важный компонент в лечении онкологических и наследственных заболеваний. Рецептор CD 34 используется как маркер полипотентных кроветворных стволовых клеток. Подсчет абсолютного числа CD34+ клеток при помощи проточной цитометрии является золотым стандартом в оценке количества кроветворных клеток.

СИСТЕМЫ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ДЛЯ СВЕТОВОГО МИКРОСКОПА

   Иммуноцито-, гистохимические методы позволяют локализовать и идентифицировать клеточные и тканевые антигены, основываясь на их связывании с антителам. Использование антител лежит в основе исследований самых разных молекулярных образований:

   Первоначально, визуализация тканевых антигенов иммуноферментными способами окраски проводилась прямым методом, использующим ферменты, непосредственно конъюгированные с антителами известной антигенной специфичности. Этот метод позволяет использовать световой микроскоп, но является низкочувствительным.

   Чувствительность иммуногистохимического окрашивания была значительно повышена с развитием непрямого способа, в котором меченые ферментом вторые антитела связываются с первыми антителами, соединенными с антигеном. Впоследствии, появились трехэтапные методы, такие как пероксидазно-антипероксидазный метод, авидин-биотиновый комплекс и другие.

   Фирмой DAKO разработаны несколько типов систем визуализации, которые относятся к новому поколению ферментопосредованных методов окраски и позволяют проводить иммунологические исследования с высокой специфичностью и чувствительностью при наличии только светового микроскопа. Это делает доступным современные методы исследований даже для лабораторий, не оснащенных специальным оборудованием.

   Системы визуализации имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными ферментопосредованными методами:

   Система визуализации EPOS (Enhanced Polymer One-Step Staining] является высокочувствительным, воспроизводимым методом непрямого иммуноокрашивания. Основой системы является уникальная декстрановая молекула, с которой связаны порядка 20 молекул специфических антител и около 100 молекул фермента, что позволяет повысить чувствительность окраски в 10-50 раз по сравнению с прямым окрашиванием. Простота (одна ступень) и быстрота (инкубация 10 минут) метода делают его наиболее удобным для экспресс-диагностики.

   Появление системы визуализации EPOS явилось революционным моментом в истории иммуно-гистохимии и послужило началом для развития целой серии систем, имеющих в своей основе декстрановую технологию.
   Основой системы EnVision™ (двухступенчатой) является та же декстрановая технология, что и в системе EPOS. Принципиальным отличием является комплекс полимерной молекулы с молекулами вторых антител (а не первых, как в EPOS), что позволяет значительно повысить чувствительность окраски и уменьшить неспецифическое связывание.
    Несмотря на большой молекулярный вес, полимерная декстрановая молекула является гидрофильной, благодаря чему система EnVision может быть также использована в иммуноферментном анализе на плашках, в методах гибридизации in situ и Вестерн блоттинге. Технология EnVision исключает влияние эндогенного биотина на результаты исследований.
   Система визуализации LSAB (Labelled Streptavidin-Biotin) (трехступенчатая) использует усовершенствованную технику, в которой биотинилированные вторые антитела, конъюгированные с ферментом, соединяются с первыми антителами, связанными с антигеном. Стрептавидин-биотиновый метод, используемый в системе LSAB имеет ряд преимуществ по сравнению с авидин-биотиновым:
> изоэлектрическая точка стрептавидина близка к нейтральной, что предотвращает неспецифическое связывание стрептавидина с заряженными группами в тканях;
> стрептавидин - белок, а не гликопротеин, поэтому не связывается с тканевыми лектинами; авидин же связывается не только С эндогенными ферментами, но и с эндогенным биотином.
   Это имеет особенно важное значение при работе со срезами ткани печени и почек, в первую очередь с замороженными. Имеются данные о неспецифическом связывании авидина с поверхностными антигенами гепатоцитов, инфицированных вирусом гепатита В.
   Высокая чувствительность систем визуализации LSAB возволяет использовать первые антитела в максимальном разведении, что значительно удешевляет исследования.
   Система визуализации CSA (Catalyzed Signal Amplification System) является наиболее высокочувствительной, позволяет работать с низкоаффинными антителами и выявлять даже незначительные количества антигена. Амплификация, т.е. усиление сигнала, осуществляется посредством добавления биотинилированного тирамида, молекулы которого при взаимодействии с ферментом переходят в нерастворимую форму и оседают непосредственно около места связывания антигена с антителом. Система пригодна для использования в методе гибридизации in situ.
   Все типы систем визуализации DAKO для светового микроскопа применимы для использования широкой гаммы первых специфических антител, предлагаемых в разнообразии как фирмой DAKO, так и другими производителями. Такая универсальность систем позволяет использовать их в:

> иммунофенотипировании клеток крови и тканей
> оценке их функционального состояния
> диагностике патологических изменений, в том числе онкологических и выявлении инфекционного поражения клеток.

   Системы визуализации могут быть использованы для исследований на парафиновых срезах, мазках, криосрезах, отпечатках и в препаратах, полученных центрифугированием клеточных суспензий. Возможность выбора субстрата позволяет получать различную окраску препаратов.
   Метод Ell-spot. Цитокины - это растворимые (глико)протеины, продуцируемые иммунокомпетентными клетками, которые обеспечивают взаимодействия между клетками гемопоэтической системы, а также клетками мозга, мышц и эндокринной системы. Большинство цитокинов секретируется, однако, некоторые могут экспрессироваться на клеточной мембране. Установлено взаимосвязанное действие цитокинов на клетки-мишени. Это комплексная сеть агонистических и антагонистических факторов со сложными механизмами регуляции и контроля. Дисбаланс в цитокиновой сети отмечается при таких патологических состояниях, как септический шок, паразитемия, онкологические и ауто-ммунные заболевания.
   Измерение количества цитокинов в биологических жидкостях является одним из путей мониторинга продукции цитокинов. Однако, многие цитокины обнаруживаются и действуют только в микроокружении продуцирующих клеток. Метод Diaclone Eli-spot базируется на иммуноферментной технологии, исходно разработанной для подсчета антител-секретирующих клеток, и, адаптированной для измерения продукции цитокинов на уровне единичной клетки. Eti-spot методика позволяет при минимальной работе с клетками in vitro проводить анализ в условиях, максимально приближенных к условиям in vivo. Принципиальная схема метода:

> стимуляция клеток к продуцированию цитокиновых молекул проводится в лунках, предварительно покрытых антителами к цитокину
> после удаления клеток комплекс цитокин-антитело выявляют с помощью вторичных биотинилированных антител к цитокинам, коньюгированных со щелочной фосфатазой
> детекция проводится на агарозном покрытии для локализации цветного продукта
  
   Цитокины, продуцированные индивидуальными клетками выявляются при помощи микроскопа как четкие голубые пятна, что позволяет подсчитать количество цитокинпродуцирующих клеток.
   Таким образом, проточная цитометрия имеет достаточно широкие возможности для решения различных диагностических и исследовательских задач, делая лабораторное исследование технологичным, точным и своевременным.